昆蟲ELISA試劑盒辦法被廣泛應用于各種抗原和抗體測定。但ELISA測定中影響要素較多，并且其操作中有必定的技能要求，在檢測過程中除正常反響外，有經常見到一些錯誤的成果。引起昆蟲ELISA試劑盒測定錯誤成果的原因主要有：①標本要素;②試劑要素;③操作要素。下面就一些常見ELISA操作過程中的問題逐個剖析。

1.樣品稀釋

酶聯免疫反響是一種靈敏性很高的反響，假如血清不稀釋，不行避免會發生很強的非特異性反響，呈現假陽性。

2.試劑盒平衡

試劑盒中一切試劑和板條均應在實驗前平衡至室溫（約25℃），一般需在室溫放置20——30分鐘以上。平衡時刻太短會形成試劑混勻不行，樣品孵育時刻相對縮短，ELISA反響不行充沛。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。

3.昆蟲ELISA試劑盒樣品和試劑的混勻

稀釋前、后的樣品必須充沛混勻，一切試劑在加樣前也須搖勻，以確保實驗的均一性。

4.加樣

在現在的ELISA試劑盒中，必定有運用微量加樣器參加樣本的步驟。留意的要害點是：加樣不行太快，要避免加在孔壁上部，不行濺起和發生氣泡。加樣太快，無法確保微量加樣的準確性和均一性

5.溫育

溫育是ELISA測定中影響測定勝敗zui為要害的一個要素。

6.洗板

固相免疫測定技能是一種非均相免疫測定技能，需以洗刷操作將特異結合于固相的抗原或抗體與反響溫育過程中吸附的非特異成份別離開來，以確保ELISA測定的特異性。

7.昆蟲ELISA試劑盒邊緣效應

運用96孔板的ELISA測定中，常發現有“邊緣效應”，即外周孔顯色較中心孔深。經研討證真實溫育中的熱力學梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導體，在實驗室的常規ELISA測定中，將板從室溫（一般在25℃左右）置于37℃溫箱，板也升溫時，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學梯度。

8.顯色

顯色必定要操控時刻，依據試劑盒闡明操作即可。一般來說，顯色時刻過短，成果偏低;顯色時刻過長，空白增高或許非特異性顯色添加。

9.比色

比色要留意波長的挑選。以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有運用，而前者比色波長為450nm，后者為492nm，濾光片需依據要求隨時替換。因而，容易呈現濾光片錯用的問題。

其次，單波長或雙波長比色挑選的問題。所謂的單波長比色便是一般的以對顯色具有吸收的波長如450nm或492nm進行比色測定;而雙波長雙色則酶標儀在靈敏波長如450nm和非靈敏波長如630nm下各測定一次，靈敏波上下的吸光度測定值為樣本測定酶反響特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、塵埃等臟物所致的吸光度之和;非靈敏波長下測定即改動波長至必定值，使得樣本測定酶反響特異顯色的吸光度值為零，此刻測得的吸光度即為臟物的吸光度值。